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针对上述问题，华南理工大学付晓玲教授团队，采用挤压方法制备了含有活性线粒体的3µm去核MSCs衍生微囊泡Mito@euMVs。顺利获得去除MSCs细胞核后进行挤压制备工程化微囊泡（euMVs），显著提升了线粒体包裹效率并形成了Mito@euMVs复合体，既保障了线粒体的活性，又避免了核基因外源转移的风险。该研究系统评估了该载体对线粒体的包封保护能力、细胞递送效能以及在高糖环境下的抗衰老作用，并创新性地设计了可溶性聚乙烯醇（PVA）微针贴片，实现了经皮高效给药。最终在糖尿病压疮大鼠模型中验证了Mito@euMVs顺利获得微针递送的体内治疗效果，为线粒体替代疗法给予了一种兼具安全性和靶向性的新型递送策略。该文章于2025年5月23日以《Inhibition and Rescue ofHyperglycemia-Induced Cellular Senescence by Mitochondrial Transfer from Enucleated Mesenchymal Stem Cell-Derived Microvesicles for Chronic Wound Healing》为题发表于《Advanced Science》（DOI: 10.1002/advs.202501612）。

研究示意图

（1）去核骨髓间充质干细胞衍生的3微米微泡包裹活性线粒体

流式细胞术显示MSC去核率超过90%（图1A），且去核MSCs保留完整质膜和活性线粒体（图1B）。顺利获得脂质体挤出技术，利用0.4 μm、1.0 μm和3.0 μm孔径的PC膜制备euMV，其中3.0 μm euMV（Mito@euMV）线粒体包裹效率最高，流式细胞术分析显示其线粒体含量为75.9%，显著高于其他尺寸（图1D）。荧光成像和HIS-SIM证实Mito@euMV保留完整膜结构并成功包封线粒体（图1E）。流式细胞仪检测显示，70.7%的Mito@euMV粒度在1.0 - 4.0 μm之间（图1F），其Zeta电位为-29.43 mV，表明稳定性良好（图1G）。透射电子显微镜（TEM）进一步确认Mito@euMV中存在线粒体（图1H），且TMRM荧光染料检测显示线粒体膜电位维持72小时以上，表明线粒体保持活性（图1I）。

图1（A）流式细胞术评估的MSC去核率。（B）去核MSC的荧光图像。（C）不同直径（0.4 μm、1.0 μm、3.0 μm）去核MSC衍生euMV的荧光图像。（D）流式细胞术分析不同直径euMV中含线粒体的比例。（E）HIS-SIM荧光图像显示Mito@euMVs。（F）流式细胞术测定Mito@euMVs的粒径分布。（G）动态光散射技术测量Mito@euMVs的Zeta电位。（H）Mito@euMVs的透射电子显微镜图像。（I）流式细胞术评估Mito@euMVs中线粒体的活性

（2）Mito@euMVs抑制和挽救高血糖诱导的成纤维细胞和HUVECs衰老表型

在高糖（35 mM）培养基中培养的成纤维细胞和HUVEC表现出细胞衰老特征（图2A）。经Mito@euMV处理5天后，成纤维细胞（图2B，C）和HUVEC（图2F，G）中衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）阳性细胞比例显著降低，而裸线粒体处理效果不明显（图2B，C）。在高浓度下，裸线粒体可降低HUVEC中SA-β-Gal阳性细胞比例，但效果不如Mito@euMV（图2F，G）。酶联免疫吸附法检测显示，Mito@euMV处理后，衰老成纤维细胞（图2H）和HUVEC（图2D）中SASP因子IL-6和TNF-α水平显著降低。此外，Mito@euMV显著下调成纤维细胞中衰老相关基因p53、p16、p21和ZBP1的表达（图2E），同时上调促进伤口愈合的关键因子TGF-β。在HUVEC中，Mito@euMV显著下调衰老相关基因p16和p21的表达，上调与功能相关的VEGF、bFGF和eNOS基因表达（图2I），表明其改善了HUVEC功能。

图2（A）诱导衰老细胞及处理示意图。成纤维细胞或HUVEC暴露于35 mM高葡萄糖DMEM培养基5天诱导衰老。（B）高糖诱导衰老成纤维细胞中SA-β-Gal的表达，有/无Mito@euMVs或裸线粒体处理的明场图像。（C）SA-β-Gal阳性成纤维细胞比例。（D）顺利获得ELISA检测Mito@euMVs处理的衰老成纤维细胞条件培养基中SASP因子IL-6和TNF-α的浓度。（E）顺利获得qPCR分析成纤维细胞中衰老相关基因（p53、p16、p21、ZBP1）及促修复基因（TGF-β）的表达。（F）高糖诱导衰老HUVEC中SA-β-Gal的表达，有/无Mito@euMVs或裸线粒体处理的明场图像。（G）SA-β-Gal阳性HUVEC比例。（H）顺利获得ELISA检测Mito@euMVs处理的衰老HUVEC条件培养基中SASP因子IL-6和TNF-α的浓度。（I）顺利获得qPCR分析HUVEC中衰老相关基因（p16、p21）及血管生成基因（VEGF、bFGF、eNOS）的表达

（3）Mito@euMVs顺利获得转移线粒体抑制和挽救高血糖诱导的细胞衰老

HIS-SIM显示，经Mito@euMV处理24小时后，衰老成纤维细胞（图3A）和HUVEC（图3H）中Mito@euMV包裹的线粒体（红色）被成功转移至受体细胞，并部分整合到受体细胞的线粒体网络中，且有少量与自噬体（MDC，绿色）共定位。这表明转移的线粒体保持活性并可能在细胞内持续发挥作用。Mito@euMV处理后，衰老成纤维细胞（图3B，C）和HUVEC（图3I，J）的线粒体膜电位显著增加，接近非衰老细胞水平。此外，Mito@euMV显著减轻了衰老成纤维细胞（图3D，E）和HUVEC（图3K，L）中异常增加的ROS产生。化学发光法检测结果显示，衰老成纤维细胞和HUVEC的ATP产生显著减少，而Mito@euMV处理后ATP产生增加（图3F，M），且衰老细胞中显著升高的ADP/ATP比率在Mito@euMV处理后显著降低（图3G，N）。这些结果表明Mito@euMV显著改善了衰老成纤维细胞和HUVEC的线粒体功能。进一步实验中，鱼藤酮抑制线粒体功能（图3O）可显著逆转Mito@euMV的作用，鱼藤酮处理组中SA-β-Gal阳性细胞比例与衰老对照组相似（图3P-S），表明Mito@euMV对细胞衰老的抑制和拯救主要归因于euMV内包裹的线粒体。

图3（A）HIS-SIM荧光图像显示MSC线粒体顺利获得Mito@euMVs转移到成纤维细胞。（B）TMRM染色显示成纤维细胞线粒体膜电位的荧光图像。（C）流式细胞术评估成纤维细胞中TMRM荧光强度。（D）DCFH-DA探针检测成纤维细胞内ROS的荧光图像。（E）流式细胞术评估成纤维细胞中DCFH-DA荧光强度。（F）化学发光法测量成纤维细胞中ATP产生。（G）化学发光法测量成纤维细胞中ADP/ATP比率。（H）HIS-SIM荧光图像显示MSC线粒体顺利获得Mito@euMVs转移到HUVEC。（I）TMRM染色显示HUVEC线粒体膜电位的荧光图像。（J）流式细胞术评估HUVEC中TMRM荧光强度。（K）DCFH-DA探针检测HUVEC内ROS水平。（L）流式细胞术评估HUVEC中DCFH-DA荧光强度。（M）化学发光法测量HUVEC中ATP产生。（N）化学发光法测量HUVEC中ADP/ATP比率。（O）鱼藤酮存在下Mito@euMVs诱导和处理衰老细胞示意图。（P）鱼藤酮存在下，Mito@euMVs处理的高糖诱导衰老成纤维细胞中SA-β-Gal表达的明场图像。（Q）SA-β-Gal阳性成纤维细胞比例。（R）鱼藤酮存在下，Mito@euMVs处理的高糖诱导衰老HUVEC中SA-β-Gal表达的明场图像。（S）SA-β-Gal阳性HUVEC比例

（4）溶解PVA微针贴片促进Mito @ euMV的经皮给药

负载Mito@euMV的溶解性PVA-MN贴片按（图4A）所示过程制备，对应的PDMS模具如（图4B）所示。每个针尖为正四棱锥形，高600 μm，底边长300 μm，贴片由10×10个针尖组成。脱模后的PVA-MN贴片与设计一致（图4C）。压缩实验（图4D）显示，20%和25%的PVA-MN比15%的PVA-MN具有更好的机械强度。使用猪皮验证MN的皮肤渗透能力，结果表明20%和25% PVA-MN的头端几乎100%穿透猪皮（图4E）。由于25% PVA-MN未表现出显著优于20% PVA-MN的机械性能，因此选择20% PVA-MN贴片用于后续实验。在体外实验中，20% PVA-MN在120秒内快速溶解，确保了Mito@euMV的有效递送（图4F）。MN中DiD标记的Mito@euMV均匀分布在每个针尖中（图4G），且MitoTracker-Green的荧光表明Mito@euMV内的线粒体在4℃下保持结构完整性至少3天，在-80℃下保持7天（图4G）。

图4（A）制备载有Mito@euMVs的溶解PVA微针（MN）贴剂的工作流程示意图。（B）用于微针贴片的PDMS模具的光学图像。（C）PVA-MN贴片的光学图像。（D）15%、20%、25% PVA-MN贴片的压缩位移机械性能。（E）15%、20%、25% PVA-MN贴片对猪耳皮肤的渗透能力。（F）20% PVA-MNs插入15% GelMA水凝胶后120秒内快速溶解的光学显微镜图像。（G）4℃和-80℃下Mito@euMVs在PVA微针中的稳定性和线粒体整体结构完整性的荧光图像

（5）Mito@euMVs促进糖尿病伤口愈合

使用糖尿病压疮大鼠模型评估了Mito@euMV的治疗效果（图5A、B）。在治疗后0、7、14和21天对伤口进行评估并计算伤口面积变化。结果显示，负载Mito@euMVs的PVA-MNs组（PVA-MN@euMVs）的伤口面积减少最明显且最迅速（图5C-E），治疗21天后伤口完全闭合。而PVA-MN组和对照组之间的愈合率无显著差异，表明Mito@euMV的释放是关键因素，而非MN本身。此外，与PVA-MN@euMV相比，皮内注射Mito@euMVs（ID@euMVs）对伤口修复的效果较差，这突显了PVA-MN贴片在促进Mito@euMV精准递送至受伤组织中的重要作用，从而实现有效伤口愈合。

图5（A）糖尿病大鼠诱导褥疮伤口的示意图。（B）伤口创建及处理、样本采集流程图。（C）接受不同治疗的大鼠糖尿病褥疮愈合代表性图像（n=6）。（D）第3、7、14、21天不同干预治疗的伤口面积比较分析。（E）治疗后第3、7、14、21天伤口面积评估

H&E染色显示PVA-MN@euMV组皮肤附属物再生最完全，包括毛囊和汗腺（图6A）。各组再生组织的表皮厚度测量结果显示，ID@euMV和PVA-MN@euMV组的新表皮厚度显著大于其他两组（图6B、C）。第21天的Masson三色染色表明，所有组均有新胶原沉积，但ID@euMV和PVA-MN@euMV组的胶原沉积更密集（图6D、E）。使用新生血管形成标记物CD31评估血管形成，IHC结果显示ID@euMV和PVA-MN@euMV诱导了最强的新血管形成，血管密度最高（图6F、G）。这些结果表明，ID@euMV和PVA-MN@euMV，尤其是PVA-MN@euMV，顺利获得促进伤口闭合和组织再生，加速了糖尿病慢性压疮伤口的修复。

图6（A）第21天愈合的糖尿病压疮的H&E染色图像，受伤区域由白色虚线划定。（B）第21天H&E染色图像显示伤口边缘，左侧为伤口区域，右侧为完整皮肤。（C）第21天各组新形成表皮厚度分析。（D）第21天伤口Masson染色代表性图像。（E）各组相对胶原沉积分析。（F）第14天伤口中CD31免疫组织化学染色代表性图像，黄色箭头指示新生血管。（G）各组伤口CD31阳性区域分析

（6）Mito@euMVs拯救伤口部位的细胞衰老

在伤口部位组织切片中检测到的细胞衰老标志物SA-β-Gal水平显示，经PVA-MN@euMV或ID@euMV处理的伤口中SA-β-Gal阳性区域比例低于PVA-MN或未处理伤口（图7A、B），表明Mito@euMV有效抑制了糖尿病伤口组织的衰老状态。多重免疫荧光（mIHC）染色结果显示，接受ID@euMV和PVA-MN@euMV处理的伤口中p53+细胞比例显著低于PVA-MN和对照组（图7C），而细胞增殖标志物Ki67+细胞比例各组间无显著差异（图7G）。巨噬细胞亚群分析显示，ID@euMV和PVA-MN@euMV组中CD68+iNOS+（M1型）细胞比例显著降低，而CD68+Arg1+（M2型）细胞比例显著增加（图7C、I、J）。此外，ID@euMV和PVA-MN@euMV处理的伤口中巨噬细胞（CD68+细胞）浸润减少（图7E、H），表明Mito@euMV有助于减轻伤口部位炎症，促进愈合。

图7（AB）第21天SA-β-Gal染色代表性图像及每单位面积SA-β-Gal阳性面积比例定量。（C）受伤组织中不同细胞表型代表性图像。（D）多重免疫荧光图像显示Arg1、iNOS、CD68、Ki67和p53染色。（E）各组伤口及边缘区域巨噬细胞浸润代表性图像。（F）各组伤口中p53+细胞定量分析。（G）各组伤口中Ki67+细胞定量分析。（H）各组伤口及边缘区域巨噬细胞浸润定量分析。（I）各组伤口中CD68+iNOS+细胞定量分析。（J）各组伤口中CD68+Arg1+细胞定量分析

（7）Mito@euMVs改善伤口组织中的线粒体功能

免疫荧光染色结果表明，成纤维细胞和HUVEC在体内能够有效摄取Mito@euMVs（图8）。负载Mito@euMVs的PVA-MN贴片显著改善了糖尿病伤口组织的线粒体功能（图8B、C），表现为ATP5A表达增加（图8B）和活性氧（ROS）水平降低（图8D，E）。虽然PVA-MN贴片本身也能降低ROS，但其效果不如负载Mito@euMVs的贴片显著，表明Mito@euMVs顺利获得改善线粒体功能和缓解炎症，在糖尿病伤口愈合中发挥了关键作用。

图8（A）第1天成纤维细胞和内皮细胞在体内摄取Mito@euMVs的代表性免疫荧光图像。（B）ATP5A染色代表性免疫荧光图像。（C）第7天每单位面积ATP5A平均荧光强度定量。（D）DHE染色代表性图像。（E）第7天每单位面积DHE平均荧光强度定量

（8）Mito@euMVs改变糖尿病伤口的蛋白质组

无标记定量蛋白质组学分析显示，接受不同治疗（PVA-MN@euMV、ID@euMV、PVA-MN和未治疗）的伤口组织具有不同的蛋白质表达谱，主成分分析（PCA）表明各组样本可聚类（图9A）。与对照组相比，差异表达蛋白质（DEP）的火山图显示显著变化（图9B）。PVA-MN@euMV治疗的伤口中，与线粒体ATP产生（如Cyb5r3和Slc44a2）和线粒体融合（如Tfrc和Tmbim6）相关的蛋白质显著上调，而与线粒体分裂（Fis1）和凋亡（Dlat、Bid）相关的蛋白质显著下调，表明细胞线粒体功能改善。PVA-MN@euMV和ID@euMV组中，与代谢、胰高血糖素信号、细胞衰老、p53信号、细胞凋亡、PI3K-Akt信号和PPAR信号相关的途径受DEP上调影响显著。基因本体（GO）富集分析显示，与对照组相比，ID@euMV和PVA-MN@euMV组中与线粒体和能量代谢（图9C、F）、抗氧化应激（图9D、G）相关的GO术语显著上调，而与细胞衰老相关的GO术语倾向于下调（图9E、H）。PVA-MN@euMV组中与线粒体、能量代谢和抗氧化应激相关的上调DEP数量显著多于ID@euMV组，差异更显著（图9I-K）。这些结果与体内组织化学染色结果一致（图7、8），表明Mito@euMV顺利获得增强线粒体功能、能量代谢和抗氧化能力，同时抑制细胞衰老，加速了伤口愈合。

图9（A）4组蛋白质表达水平的主成分分析（PCA）显示PC1和PC2完全分离。（B）火山图显示差异表达蛋白（DEP），灰色为不显著基因，红色为上调基因，蓝色为下调基因。（C-E）GO弦图显示ID@euMVs与对照组间DEPs与线粒体富集途径的关系，涉及能量代谢（C）、抗氧化应激（D）和细胞衰老（E）。（F-H）GO弦图显示PVA-MN@euMVs与对照组间DEPs与线粒体富集途径的关系，涉及能量代谢（F）、抗氧化应激（G）和细胞衰老（H）。（I-K）热图展示参与线粒体和能量代谢（I）、抗氧化应激（J）和细胞衰老（K）的DEP