奥林匹斯之门 pp电子奥林匹斯之门

基于上述背景，广州医科大学附属肿瘤医院郑燕芳主任和暨南大学郭瑞教授团队合作设计并构建了一种能够共同递送siARH 2和ART的pH/ROS响应纳米系统，该纳米系统有效地激活了肿瘤细胞和肿瘤相关巨噬细胞的免疫反应。此外，该纳米系统表现出优异的体内安全性、精确的PD-L1靶向以及对ROS和pH变化的响应性。它能显著抑制巨噬细胞诱导的肿瘤细胞恶性表型，增强T细胞介导的免疫应答。总的来说，靶向ARH 2与ART的组合代表了治疗LUAD的有希望的新策略。该文章于2025年8月2日以《Inhibition of ARH2 by pH/ROS-responsive nanosystem for improved lung adenocarcinoma immunochemotherapy》为题发表于《Bioactive Materials》（DOI：http://doi.org/10.1016/j.bioactmat.2025.07.042）。

图1. 共同递送的 siARH2 和 ART 的纳米系统对肿瘤微环境的响应示意图

（1）ARH2在肺腺癌中的表达与免疫抑制的关系

使用TCGA数据库，第一时间顺利获得ESTIMATE算法计算了肺腺癌患者的免疫评分。免疫评分较高的患者存活时间明显较长（图2A）。相反，较低的免疫评分与较高的T分期和分期评分相关（图2B、C）。在将免疫评分分为高和低免疫评分组后，鉴定了两组之间的差异表达基因（DEG），并对这些DEG进行了考克斯回归分析。分析显示，6个靶基因（ARH2、TERT、BCAN、S100P、FAM83F和INHA）与免疫评分呈负相关，且其高表达均与低免疫评分及不良预后相关（图2D）。这6个基因的基因集富集分析（GSEA）提示ARH2主要与免疫调节相关。高ARH2表达与多种免疫调节途径的抑制相关，并与患者预后不良相关（图2E、F）。此外，与配对的邻近组织相比，癌组织中ARH2的表达显著升高（图2G）。表明ARH2在肺腺癌中发挥免疫抑制作用。

图2.（A）基于TCGA的LUAD中免疫评分和生存期之间的相关性。（B） LUAD不同T分期间免疫评分的变化。（C）不同肿瘤分期间免疫评分的差异。（D） 6个基因与免疫评分和生存期呈负相关。（E）GSEA在高表达ARH2的LUAD中显示了多种免疫应答信号通路的抑制。（F） LUAD中ARH2表达和存活之间的关联。（G）ARH2在LUAD组织中的表达显著高于邻近的正常组织

（2）ARH2促进巨噬细胞的M2极化

ARH2主要定位于肿瘤周围肺泡腔内的M2型巨噬细胞（CD206+）。M2型巨噬细胞浸润增多与肿瘤组织中CD8+ T细胞减少相关（图3A）。体外CCK-8实验显示敲减ARH2对肿瘤细胞增殖无显著影响。TCGA-GSEA证实ARH2表达与M2极化正相关（图3B）。巨噬-肿瘤细胞共培养体系中，敲减ARH2抑制M2极化并降低IL-10、Arg-1表达（图3C、D），同时减少肿瘤细胞向巨噬细胞的迁移。IL-4诱导的M2巨噬细胞与激活Jurkat淋巴细胞共培养时，敲减ARH2提高CD69表达及IFN-γ分泌（图3E–H），而过表达ARH2则增强M2极化及抗炎因子表达并抑制淋巴细胞激活和IFN-γ分泌（图3G–I）。

图3.（A）ARH2、CD206及CD8在肺腺癌组织中的表达定位；（B）肿瘤细胞与THP-1共培养示意图；（C、D）敲减ARH2抑制A549共培养诱导的M2极化及抗炎因子表达；（E）THP-1与Jurkat共培养示意图；（F、G）CD3/CD28预激活Jurkat与不同处理M2巨噬细胞共培养后淋巴细胞激活标志检测；（H、I）同前共培养体系上清IFN-γ水平测定

（3）ARH2负调控FPR2促进M2巨噬细胞极化

TCGA高、低ARH2表达组差异基因分析显示ALDH3A1、NQO1与ARH2正相关，而IL12RB2、FPR2与ARH2负相关（图4A）。上述四个基因与免疫反应密切相关。QRT-PCR和蛋白质印迹（WB）验证显示，ARH 2抑制显著上调FPR 2表达，而ALDH3A1、NQO 1和IL12 RB2表达保持不变（图4B和C）。巨噬细胞中的ARH 2过表达导致FPR 2表达的显著降低。当将FPR 2拮抗剂WRW 4引入ARH 2抑制的巨噬细胞时，肿瘤细胞诱导的M2巨噬细胞极化被逆转，并恢复IL-10与Arg1表达（图4D和E）。ARH 2抑制还减弱PI 3 K/AKT磷酸化，过表达ARH2则增强该磷酸化（图4F）。这些发现表明ARH 2调节FPR 2/PI 3 K/AKT通路，影响M2巨噬细胞的极化。

图4.（A）ARH2高低表达差异前20基因热图；（B）THP-1敲减ARH2后FPR2 mRNA升高；（C）THP-1敲减ARH2后FPR2蛋白升高；（D、E）MH-S敲减ARH2并用WRW4阻断FPR2后M2极化及IL-10、Arg1表达恢复；（F）THP-1敲减ARH2后AKT与PI3K磷酸化增强

（4）pH/活性氧双重释放纳米系统的合成

第一时间，构建纳米壳，并顺利获得以下方式进行验证：1H NMR 与 FTIR 表征确认 mPEG 已连接醛基（图 5A、B）；VES 与乙二胺酰胺化生成 VES-NH₂（图 5C），后者与 mPEG-CHO 缩合得到 VES-N=C-mPEG（VG）（图 5D、E）。VP 由 VES 与 PLL 经酰胺反应并引入双硒键合成（图 5F、G），再与 ART 偶联得 VPA，药物负载量 24.67 %（图 5H）。VPA/VG 与核酸质量比 30:1 时，粒径与电位恢复至复合前水平（图 5I、J）；凝胶电泳显示该比例下核酸迁移受限，提示 siRNA 被完全包载（图 5K）。TEM 表明 VPA/VG 在 pH 7.4 PBS 中呈球形，弱酸中保持结构；100 μmol/mL H₂O₂ 引发解体，证实其氧化响应性（图 5L）。粒径测定：pH 6.5 时 VG 与 VPA/VG 明显缩小，VPA 增大（图 5M、N）；电位测定显示 VPA 表面正电更高，VPA/VG 因 VG 包覆而降低。多溶剂稳定性测试表明 VPA/VG 结构稳定（图 5O）。药物释放实验 24 h 内，ART 在弱酸＋高氧化条件下释放最快（图 5P）。

图5.（A、B）FTIR与1H NMR确认mPEG与mPEG-CHO； （C）1H NMR验证VES与VES-NH₂；（D、E）1H NMR及FTIR显示VES-NH₂、mPEG-CHO缩合为VES-N=C-mPEG；（F、G）FTIR与1H NMR表征VES、Se-CYS、PLL生成VES-Se-Se-PLL；（H）FTIR比较ART、VP与VPA；（I、J）不同N/S比下VPA/siARH₂粒径与ζ电位；（K）VPA/siARH₂凝胶阻滞分析；（L）VPA/VG复合物在不同pH/ROS环境的TEM形貌；（M、N）pH 7.4与6.5时各组粒径及电位；（O）VPA/VG在多种溶剂中5 d粒径稳定性；（P）ART标准曲线与释放曲线

（5）pH/ROS响应纳米系统的体外抗肿瘤作用

为了评估纳米颗粒的抗肿瘤功效，CCK-8测定结果表明，在20 μg/ml的包封ART剂量下，VP和VG均未表现出显著的急性毒性。流式细胞术检测其抗肿瘤活性和活性氧的产生。结果显示，VPA/VG表现出最有效的抗肿瘤功效并产生相对高水平的ROS（图6A、B）。为了研究pH依赖性效应，CCK-8测定和FCM确定在用ART和纳米系统处理后在各种pH条件下的细胞存活率和凋亡率。与中性条件相比，单独的ART在酸性环境中没有显著增加细胞死亡。相比之下，纳米系统表现出显著增强的诱导肿瘤细胞死亡的能力，特别是在酸性条件下（图6C、D）。此外，坏死性凋亡抑制剂和ROS清除剂的使用有效地抑制了纳米系统诱导的细胞死亡（图6E、F）。这些发现表明，纳米系统具有pH响应特性，并促进ROS生成，导致肿瘤细胞中的nec凋亡。

图6.（A）不同纳米体系诱导细胞死亡比例的流式检测；（B）各组胞内ROS水平的流式测定；（C、D）不同pH下纳米体系与ART对肿瘤细胞杀伤能力的流式及CCK-8分析；（E、F）坏死抑制剂与ROS清除剂存在时，纳米体系诱导肿瘤细胞凋亡率及抑制率的流式与CCK-8评估

（6）PD-L1靶向纳米系统增强肿瘤靶向

为了评估纳米系统的siRNA转染效率，使用FCM测量Cy 5标记的siRNA的荧光强度（图7A）。WB和qRT-PCR分析证实纳米系统有效地下调ARH 2表达。此外，当纳米系统与PD-L1靶向肽偶联时，其在调节ARH 2表达方面表现出增强的功效（图7 B、C）。抑制MH-S细胞中PD-L1的表达导致细胞对纳米颗粒系统的摄取减少（图7D、E）。此外，纳米系统与PD-L1靶向肽的缀合也增加了它们对肿瘤细胞的细胞毒性。然而，当纳米系统负载siARH 2时，它们的肿瘤抑制作用保持不变（图7F、G）。这些结果表明，PD-L1靶向肽的掺入使纳米系统能够特异性靶向并将siARH 2递送到肿瘤细胞中，从而增强其治疗潜力。

图7.（A）Cy5-siARH2复合物处理48 h后LLC与MH-S细胞的流式摄取结果；（B、C）不同复合物处理下MH-S细胞ARH2 mRNA及蛋白相对表达量；（D）WB检测MH-S细胞PD-L1表达；（E）FCM分析PD-L1沉默细胞的纳米药物摄取；（F、G）细胞凋亡与CCK-8评估各组A549细胞杀伤能力

（7）纳米系统抑制肿瘤生长并增强体内巨噬细胞免疫反应

图8A示尾静脉注射后，VPA/VG组小鼠生存期最长（图8B）；FCM与IHC显示其肿瘤内M2巨噬细胞（CD206⁺/Arg1⁺）显著减少、M1巨噬细胞（iNOS⁺）显著增加（图8C、D）。VP/VG包载siARH2未延长生存期，而共载ART与siARH2后生存期超过VPA/VG组（图8E），且肿瘤内M2巨噬细胞进一步降低、M1巨噬细胞升高（图8F、G）。

图8.（A）LLC荷瘤小鼠模型建立及给药方案；（B）各组小鼠生存曲线；（C、D）FCM与IHC检测不同处理肿瘤浸润巨噬细胞面积；（E）各组小鼠生存曲线；（F、G）FCM与IHC再次量化肿瘤浸润巨噬细胞面积

（8）与PD-L1靶向肽缀合的合成纳米系统提高了肿瘤靶向和抗肿瘤功效

为了研究纳米系统的生物分布，将Cy 5标记的siARH 2掺入到系统中，并进行体内成像。结果表明，Cy5-siARH2标记纳米体系静脉注射24 h后，肿瘤荧光信号显著且PD-L1靶向肽进一步增强定位（图9A）；12、24、36 h动态成像显示肿瘤蓄积递增，肝肾信号递减（图9B）。PD-L1肽修饰体系显著抑制皮下瘤生长并降低瘤内M2巨噬细胞（图9C–E），同时减少肺转移灶数目及M2浸润（图9F、G）；脾脏FCM示CD8⁺ T细胞比例显著升高（图9H）。

图9.（A）静脉注射合成的纳米系统24小时后，肿瘤小鼠器官的体内荧光成像。（B）采用组织成像技术检测不同时间点VPA-siARH 2-PDL 1 pep/VG在不同组织中的蓄积。（C）不同处理的LLC荷瘤小鼠中分离的肿瘤。（D）荷瘤小鼠经不同处理后的肿瘤生长曲线。（E）IHC用于评估不同处理组肿瘤中M2巨噬细胞的数量（左）。浸润的Arg 1阳性巨噬细胞的相对数量（右）。（F）肺组织切片的HE染色显示（左）。肺转移性肿瘤的定量（右）（G）小鼠肺转移瘤中M2型巨噬细胞含量的IHC分析（左）。浸润的Arg 1阳性巨噬细胞的相对数量（右）。（H）CD 3 + CD 8 + T细胞的代表性FCM结果（左）和定量分析（右）

（9）纳米系统顺利获得调节FPR 2/AKT信号通路增强免疫反应

体外实验结果表明，经PD-L1靶向肽偶联纳米系统处理的MH-S巨噬细胞中，FPR2表达显著上调，同时PI3K/AKT磷酸化水平明显下调（图10A）。荷瘤小鼠肿瘤组织的IHC染色进一步验证了这一发现，显示FPR2丰度升高且p-AKT降低，其中PD-L1靶向肽修饰组效果最为显著（图10B）。多重免疫荧光（MIF）定量分析揭示，该纳米系统重塑肿瘤免疫微环境：与对照相比，治疗组肿瘤内CD206⁺ M2型巨噬细胞浸润减少，CD86 ⁺ M1型巨噬细胞浸润增加，并伴随CD8⁺ T细胞显著募集（图10C）。结果说明该纳米系统可顺利获得FPR2/AKT信号轴有效激活抗肿瘤免疫应答。

图10（A）WB法检测不同药物处理后MH-S细胞中FPR2、AKT、PI3K、p-AKT和p-PI3K的表达。（B）IHC检测用不同药物处理小鼠肿瘤中FPR2、AKT和p-AKT的表达。（C）进行多重免疫荧光以定量小鼠肿瘤组织中CD8⁺、CD86+或CD206⁺细胞群的变化