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针对上述问题，四川大学程冲、邱逦、张勃庆团队合作设计并构建了一种集声激活肿瘤消除与智能骨修复于一体的3D打印仿生复合支架系统。该系统顺利获得原位构筑负载铱簇（Ir clusters）的钛基纳米酶材料（ICTO），并将其高效沉积于具有良好骨传导性能的羟基磷灰石（HA）支架表面，形成HS-ICTO复合支架。在肿瘤微环境中，该支架顺利获得仿过氧化物酶（POD）、氧化酶（OXD）活性，联合超声激发，实现对H₂O₂的催化转化，产生大量ROS，诱导肿瘤细胞发生线粒体损伤和凋亡；同时其仿催化酶（CAT）活性可分解H₂O₂生成氧气，缓解缺氧状态，增强声敏响应效率。进入术后修复阶段后，该材料又可智能转化功能，顺利获得清除过量ROS、缓解氧化应激、维持红氧平衡，调控干细胞向成骨方向分化，并抑制破骨细胞活性，重建骨再生与吸收的动态平衡。整体来看，该研究构建了一种可响应氧化压力变化并实现阶段性功能切换的治疗系统，不仅在根除肿瘤方面具备精准可控性，还能有效有助于组织再生，为骨肉瘤保肢治疗给予了智能化、多功能、可转化的新型策略。该文章于2025年7月4日以《Sono-activable and biocatalytic 3D-printed scaffolds for intelligently sequential therapies in osteosarcoma eradication and defect regeneration》为题发表于《Nature Communications》上（DOI：10.1038/s41467-025-61377-x）。

图1. 声激活与仿酶催化3D打印支架用于骨肉瘤保肢治疗的设计。（a）ICTO纳米酶及其修饰的3D打印羟基磷灰石支架（HS-ICTO）的构建过程；（b）在肿瘤微环境中实现可控ROS产生以智能清除肿瘤细胞；（c）术后顺利获得清除过量内源性H₂O₂并重塑氧化还原稳态以促进骨再生

（1）HS-ICTO的合成与表征

采用湿法蒸发沉积策略将ICTO纳米酶材料负载于3D打印HA支架表面，构建HS-ICTO复合支架（图2a）。扫描电镜观察显示，ICTO在支架表面均匀沉积，未显著改变原始结构（图2b–d），且元素映射证实Ti、Ir等元素分布均一（图2f）。TEM与HRTEM图像显示，ICTO呈花瓣状片层结构，Ir纳米簇平均粒径约为1.7 nm，规则附着于TiO₂表面，具备清晰晶面条纹（图2e–h）。HAADF-STEM与FFT图进一步确认Ir簇在TiO₂上的分布与晶体结构（图2i）。XPS测试揭示Ir以Ir⁰和Ir⁴⁺两种价态共存，且与TiO₂形成Ir-O-Ti结构，表现出电子转移特征（图2j, k）。XANES与EXAFS分析进一步证实Ir簇处于介于Ir⁰与IrO₂之间的平均氧化态，并存在显著的Ir–O–Ti配位结构（图2l–n）。综合结果表明，ICTO纳米酶在HS支架上稳定负载，并具备良好的结构完整性和氧化还原催化潜力。

图2. HS-ICTO支架的形貌与结构表征。（a）从毫米级到原子尺度的多尺度结构示意图；（b）HS-ICTO的SEM图像；（c, d）放大SEM图像；（e）ICTO的TEM图像；（f）ICTO的元素映射图；（g, h）ICTO的高分辨TEM图像；（i）ICTO的HAADF-STEM图像及其对应的FFT图；（j, k）Ir 4f与Ti 2p区域的XPS光电子谱；（l）Ir L₃边的XANES谱；（m）Ir L边EXAFS的傅里叶变换k³加权谱图；（n）k³加权EXAFS信号的WT图像

（2）类酶生物催化评价及机理分析

ICTO具备良好的POD-与OXD类酶仿活性，TMB显色实验显示其在弱酸环境下产生ROS的能力优于TO，具有TME特异性（图3a–b）。动力学参数分析显示ICTO的Vmax和TON分别为3.51×10⁻⁷ M/s和21.60×10⁻³ s⁻¹，均高于TO，同时Km值更低（图3c）。在GSH过表达环境中，ICTO可显著消耗GSH，降低ROS清除水平（图3d）。自由基清除与EPR实验确认ICTO可高效生成•O₂⁻和¹O₂，超声激发可进一步增强ROS产量（图3e）。此外，在中性条件下，ICTO表现出优异的CAT类酶仿活性，20分钟内可清除约90%的H₂O₂，并显著提升O₂生成，Vmax为48.23 μM/s，TON为4.11 s⁻¹（图3f–g）。

密度泛函理论（DFT）计算揭示，在酸性环境中，H₂O₂在Ir位点顺利获得IrOH中间体生成•OOH，其反应能垒为0.51 eV，为POD样反应的限速步骤（图3h–i）。中性条件下CAT样反应的关键步骤为O₂和H₂O脱附，能垒分别为0.34 eV和0.38 eV，显示其高效催化特性。PDOS分析表明OH(Ir)在费米能级附近电子态密度高于OH(Ti)，反应活性更强（图3j）。差分电荷密度与Bader电荷计算结果显示，Ir-O键弱于Ti-O键，利于OH(Ir)解离与持续反应（图3k–l）。综上，ICTO具备酸性条件下高效ROS生成与中性条件下H₂O₂清除并释氧的双重仿酶活性，源于其Ir-O-Ti界面结构所赋予的协同电子转移特性，适配肿瘤清除与术后再生的双重治疗需求。

图3. ICTO的仿酶催化活性与理论计算。（a）ICTO结构特性与多酶样催化活性的示意图；（b）POD样与OXD样催化活性（TMB显色，652 nm）；（c）ICTO与TO的动力学参数比较；（d）DTNB捕获法检测GSH耗竭能力；（e）EPR检测·O₂⁻和¹O₂的生成；（f）中性条件下ICTO与TO的H₂O₂清除与O₂生成能力；（g）Vmax与Km参数对比分析；（h）POD样与CAT样催化反应路径；（i）对应的吉布斯自由能变化图；（j）ICTO中OH（Ir）与OH（Ti）的O 2p轨道PDOS分析；（k）差分电荷密度分布图；（l）OH（Ti）与OH（Ir）的Bader电荷计算结果

（3）骨肉瘤根除的体外治疗效果

3D打印支架HS-ICTO在TME条件下展现出POD-与CAT样活性，并顺利获得超声协同增强ROS生成，维持稳定催化性能（图4a–c）。不同浓度HS-ICTO支架对BMSCs无毒性，而对143b细胞呈剂量依赖性抑制作用，HS-ICTO-2.0 + US组细胞存活率最低，仅为9.7%，因此选用该浓度用于后续分析。RNA-seq显示，HS-ICTO及其联合US处理均显著改变143b细胞的基因表达谱，富集于细胞凋亡、ROS损伤及应激反应相关通路（图4d–f）。CLSM图像显示，HS-ICTO处理显著减少活细胞数，HS-ICTO + US组几乎无存活细胞（图4g）。流式细胞术进一步验证143b细胞的早晚期凋亡比例分别在HS-ICTO组和HS-ICTO + US组升高至45.08%和87.13%（图4h）。Western blot检测显示HIF-1α在HS-ICTO及HS-ICTO + US组中表达均显著下调，表明支架具备缓解缺氧的能力，增强超声疗效（图4i）。综上，HS-ICTO支架在TME下顺利获得仿酶与超声协同机制增强ROS积累，诱导线粒体功能损伤与细胞凋亡，展现出显著的体外抗肿瘤治疗潜力。

图4. HS-ICTO支架在体外骨肉瘤治疗中的效果评估。（a）TME条件下HS-ICTO的治疗机制示意图；（b）TMB显色检测HS-ICTO-x的POD样活性；（c）HS-ICTO联合超声触发TMB和DPA的催化氧化反应；（d）不同细胞样本的PCA分析图；（e）HS-ICTO + US与HS、HS-ICTO与HS的差异基因火山图；（f）143b细胞中与ROS相关的GO富集分析结果；（g）不同治疗下143b细胞在支架上的活/死染色CLSM图像；（h）Annexin V-FITC/PI双染流式细胞凋亡分析；（i）不同处理组143b细胞中HIF-1α蛋白的表达水平Western blot检测

（4）骨肉瘤异种移植物的体内治疗效果

在143b骨肉瘤皮下异种移植模型中验证HS-ICTO的体内抗肿瘤疗效（图5a）。治疗期间，HS-ICTO与HS-ICTO + US组均显著抑制瘤体生长，其中HS-ICTO + US组抑瘤率达90.43%，显著优于其他组（图5c–f）。小鼠体重、主要脏器H&E染色及溶血实验均未显示明显毒性（图5g）。肿瘤组织的H&E染色显示，HS-ICTO与HS-ICTO + US组出现核固缩、胞质收缩及组织破坏等典型损伤特征（图5h）。TUNEL染色结果显示HS-ICTO + US组DNA断裂最严重（图5i），Caspase-3免疫荧光进一步确认其显著诱导细胞凋亡。Ki67染色结果显示HS-ICTO + US组肿瘤细胞增殖水平最低（图5j）。综上，HS-ICTO支架在体内具有良好的生物安全性和协同抗肿瘤疗效，能顺利获得缓解TME缺氧、增强ROS生成，有效诱导肿瘤细胞凋亡并抑制增殖。

图5. HS-ICTO在体内骨肉瘤异种移植模型中的治疗效果。（a）143b异种移植瘤构建及治疗流程示意图；（b）HS-ICTO清除骨肉瘤的机制示意图；（c）第15天取瘤后的实体照片；（d）瘤体积变化曲线；（e）第15天瘤组织称重结果；（f）瘤体生长抑制率统计；（g）小鼠体重变化热图；（h）不同组瘤组织的H&E、TUNEL及Ki67荧光染色图；（i）TUNEL阳性细胞数量统计；（j）Ki67荧光强度定量分析

（5）体外氧化还原稳态调节和干细胞保护

HS-ICTO展现出良好的CAT类酶仿活性，可在中性及酸性条件下高效分解H₂O₂并释放O₂，且其活性随ICTO负载量增加而增强（图6a–c）。在H₂O₂刺激下，HS-ICTO可有效维持BMSCs的活性与铺展能力，显著降低ROS水平（图6d–e）。TEM观察显示，HS + H₂O₂组细胞出现线粒体与内质网损伤，而HS-ICTO + H₂O₂组细胞结构基本完整（图6f）。在成骨诱导条件下，HS-ICTO可显著逆转H₂O₂对ALP活性（第14天）与钙沉积（第21天）的抑制（图6g–j），且无支架共培养组中成骨标志物表达最低，提示HA具一定成骨诱导作用。免疫荧光与RT-qPCR结果显示，HS-ICTO可恢复Runx2、BMP-2、COLI和ALP的表达水平（图6k–m），与无支架组对比亦明显上调。综上，HS-ICTO可有效调控H₂O₂相关氧化还原稳态，保护BMSCs在骨缺损环境中的活性、迁移及成骨能力（图6n）。

图6. HS-ICTO在体外调控氧化还原稳态并保护干细胞免受氧化应激损伤的作用。（a）骨缺损条件下HS-ICTO调控H₂O₂平衡与缓解缺氧的机制示意图；（b）HS与不同浓度HS-ICTO对H₂O₂的清除效果；（c）在H₂O₂存在下HS与HS-ICTO产生氧气的能力；（d）不同处理下BMSCs在支架上培养5天的活/死染色CLSM图及CCK-8检测结果；（e）BMSCs骨架染色图及细胞面积统计；（f）BMSCs超微结构TEM图，红箭头为损伤线粒体，红星为膨胀内质网；（g）成骨诱导14天后的ALP染色图；（h）成骨诱导21天后的ARS染色图；（i, j）ALP与ARS阳性染色面积定量分析；（k）BMSCs成骨诱导14天后Runx2、BMP-2与COLI的免疫荧光染色图；（l）Runx2、BMP-2与COLI的平均荧光强度统计；（m）BMSCs在不同处理下Runx2、BMP-2、COLI与ALP的基因表达水平；（n）HS-ICTO调控氧化还原稳态并保护BMSCs的机制示意图

（6）抑制破骨细胞生成

K7M2与RAW264.7共培养7天后，RAW264.7细胞中NFATc1、c-Fos、MMP-9和ACP5等破骨细胞相关基因表达显著上调，提示骨肉瘤细胞可诱导破骨分化（图7a–b）。HS-ICTO可能顺利获得清除H₂O₂和供氧缓解ROS和缺氧信号，抑制破骨生成（图7c）。RANKL诱导实验显示，HS组未抑制多核巨大细胞形成，HS-ICTO组破骨细胞面积显著缩小（图7d–e）。TRAP染色进一步证实，HS-ICTO组TRAP阳性细胞数明显减少（图7f–g）。 RT-qPCR结果显示，HS-ICTO组中NFATc1、c-Fos、MMP-9和ACP5的表达分别下降至0.32、0.57、0.43和0.18（图7h）。Western blot分析发现，HS-ICTO能有效抑制RANKL刺激下RAW264.7细胞中HIF-1α蛋白表达，而HS与HS + RANKL组则无此效应（图7i）。以上结果表明，HS-ICTO可顺利获得调控ROS与缺氧信号轴抑制破骨细胞活性，从而缓解骨肉瘤相关的骨破坏并促进术后骨修复。

（7）促进骨缺损重建

在大鼠颅骨缺损模型中，HS-ICTO组与HS组在第4、8、12周分别进行组织学与影像学评估（图8a）。RNA-seq显示HS-ICTO显著下调炎症（如CXCL6、TNF）、破骨（如NFATC1、MMP9）、ROS应答（如GPX1、BTG1）及缺氧相关基因（HIF1A，fold change = 0.58，P = 0.009）（图8b-d）。H&E与Masson染色结果显示，HS-ICTO组在各时间点均表现出更多新生骨与胶原沉积（图8e–f）。Micro-CT结果显示，第8周HS-ICTO组BV/TV为31.3%，显著高于HS组的23.2%（P = 0.0217）；第12周分别为43.6%与28.7%（P = 0.0060），Tb.N亦显著提升（0.40 mm⁻¹ vs. 0.31 mm⁻¹，P = 0.0084）（图8g–i），BMD升高、Tb.sp减小。Runx2、BMP-2与COLI免疫荧光染色显示，HS-ICTO组阳性细胞比例更高（图8j–l），提示其具备更强成骨诱导能力。TRAP染色显示HS组周围有明显破骨活性，而HS-ICTO组染色区显著减少。综上，HS-ICTO可有效恢复骨形成与骨吸收的平衡，显著促进缺损区域的骨组织重建。